Caracterización de la actividad RdRp y estudio de la interacción con factores celulares de la proteína NS5 de Flavivirus

Abstract

Los virus de la familia Flaviviridae son responsables de distintos tipos de enfermedades que incluyen hepatitis, síndromes neurológicos, fiebres hemorrágicas, etc. Esta familia comprende cuatro géneros: Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus y Pegivirus. En esta Tesis Doctoral se han clonado las proteínas NS5 y el dominio con actividad RdRp de los flavivirus Usutu, West Nile y Zika, en vectores de expresión en bacterias y en células de mamífero. Los plásmidos de expresión en bacterias han sido usados para la sobreexpresión y purificación de las proteínas recombinantes. Esto nos ha permitido estudiar la actividad RdRp in vitro de estas proteínas y finalmente analizar si in vitro éstas son fosforiladas por Akt y determinar cuáles son los residuos que se fosforilan. Los plásmidos de expresión en células eucariotas nos han permitido expresar en cultivos de líneas celulares las proteínas virales y estudiar si interaccionan con Akt in vivo. Estos plásmidos también nos han permitido estudiar localización subcelular de las proteínas. Adicionalmente se han llevado a cabo experimentos de infección con diferentes tratamientos que permiten inhibir Akt para intentar esclarecer los efectos de la quinasa celular Akt y su papel en la modulación de la replicación de los virus de la familia Flaviviridae. Nuestros resultados sugieren que las proteínas NS5 de los flavivirus podrían ser objeto de modificaciones postraduccionales impulsadas por Akt, y cuyos objetivos podrían ser tanto la modulación de la actividad ARN-polimerasa como desempeñar un papel regulador en el ciclo replicativo del virus. La caracterización de esta interacción arrojará luz sobre la interacción del virus con la célula hospedadora y su efecto en la replicación viral.